本文系Food Science and Human Wellness原创编译，欢迎分享，转载请授权。Introduction副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性嗜盐菌，常见于虾、鱼、贝类等海产品中，极易引起腹泻。在中国和印度的沿海地区和非沿海大城市，该细菌已成为主要的食源性病原体。副溶血性弧菌的致病性，包括溶血活性、肠毒性和细胞毒性，主要归因于毒力基因tdh和trh的存在，它们编码耐热性直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）。虾以其独特的口感和营养价值，成为世界上最美味、最受欢迎的食物之一。对于消费者来说，其新鲜度被认为是最重要的因素，因此，冷冻是最广泛使用的保持其新鲜度的工艺。在冷冻过程中，副溶血性弧菌会经历洗涤、冷冻、解冻等应激过程。为了减轻这些胁迫，该病原菌启动多种防御策略，如产生冷休克蛋白，然而携带tdh和/或trh基因的致病株可以显著增加其对冻结条件的抵抗力。因此，在冷冻虾制品中带有tdh和/或trh基因的副溶血性弧菌是值得关注的食品安全问题。此外，许多报道指出，在冷冻过程中，会出现副溶血性弧菌转变为可存活但不可培养（VBNC）状态。VBNC细胞在固体培养基上通常会失去培养能力，但在适当的条件下仍然具有功能活性，并具有潜在的致病性，在合适的条件下可以复苏。近年来，食品行业一直在关注致病菌的VBNC细胞可能会逃避检测，并仍然保持毒性。然而，很少有研究关注食品加工过程中对VBNC细胞的诱导及其致病性的变化。西北农林科技大学食品科学与工程学院刘斌副教授、赵旭博副教授，及其研究生高增晖 ，在本文中测定了中国对虾在冷冻加工过程中副溶血性弧菌的毒力变化，包括数量、VBNC状态、毒素和毒力基因等，以了解该病原菌在加工胁迫下的致病性和分子适应情况，为今后的冻虾加工提供科学依据和支持。Results and Discussion在冷冻过程中，副溶血性弧菌ATCC17802和ATCC33847分别降低了0.90（lg (CFU/mL)）和1.55（lg (CFU/mL)）（图1）。其中，沥干阶段降低最显著，分别为0.55（lg (CFU/mL)）和1.45（lg (CFU/mL)）。在喷淋阶段，他们的数量也出现下降，但只有ATCC17802呈显著下降。在速冻阶段两株细菌数量变化都没有明显差异。而在渡冰衣阶段，两株菌的数量均略有上升趋势，分别为0.30（lg (CFU/mL)）和0.26（lg (CFU/mL)），这表明副溶血性弧菌在长期的冷冻过程中也能生长。图1 冻虾加工过程中两株致病性副溶血性弧菌落数变化为了检测对虾冷冻加工过程中VBNC状态的副溶血性弧菌，从5个关键控制点采集细菌，使用LIVE/DEAD® BacLightTM细菌活力试剂盒染色，用激光共聚焦显微镜观察，并将染色结果用ImageJ软件对绿色活菌计数（图2）。加工过程中，两株菌在速冻前迅速减少，但在之后开始缓慢增加，这与平板计数结果不同。在沥干阶段细菌数量明显下降，说明清洗能够减少附着在对虾上的副溶血性弧菌。然而在共聚焦激光显微镜观察下，在喷淋阶段细菌的减少是因为副溶血性弧菌已经进入了VBNC状态，这说明在制作冻被时，细菌开始逐渐进入VBNC状态图2 副溶血性弧菌的活细胞和死细胞及活细胞计数在对虾冷冻加工过程中，副溶血性弧菌ATCC17802和ATCC33847菌株接种到中国对虾后，在我妻氏血琼脂平板上产生清晰的透明溶血环。与此同时，阳性对照组（接种副溶血性弧菌菌液）和阴性对照组（对虾中未接种副溶血性弧菌），均很难在我妻氏血琼脂上观察到类似溶血环（图3）。这些结果表明，副溶血性弧菌接种中国对虾后，这些菌株的毒力会变的更强。图3 副溶血性弧菌神奈川试验随后对冻虾加工过程中副溶血性弧菌总溶血活性进行测定。副溶血性弧菌ATCC17802的溶血活性较低，但在冷冻过程中仍从OD570值的0.23缓慢上升至0.35。但是副溶血性弧菌ATCC33847，其溶血活性迅速增加2倍以上（OD570值从0.49到1.08），并从喷淋解冻阶段后继续增加。这些结果表明，这些副溶血性弧菌菌株即使在冷冻的环境中仍然具有毒性。图4 副溶血性弧菌在冷冻过程中的总溶血活性两株菌的tlh基因的相对表达量在加工过程中都表现出相似的增长规律，说明基因表达的结果是可靠的。在冷冻过程中，副溶血性弧菌ATCC17802的trh基因相对表达量逐渐下调，在沥干和喷淋解冻阶段比前一阶段减少了将近一半。然而在喷淋阶段后，相对表达量开始上调，这表明TRH仍能在冷冻环境下合成，但是 会在解冻过程通过水淋导致流失。副溶血性弧菌ATCC33847的tdh则刚好相反，相对表达量逐渐上调，并在渡冰衣阶段增长到接种阶段两倍。这些结果表明，即使在冷冻温度下，TRH和TDH仍然可以合成，这与总溶血活性试验的结果基本一致。图5 副溶血性弧菌毒力基因tdh、trh和tlh的相对表达Conclusion在整个加工过程中，两株副溶血性弧菌的数量均未大幅度减少，仅分别降低了1.55（lg (CFU/mL)）和0.90（lg (CFU/mL)）。其中，在清洗和喷洒阶段，细菌数量有显著减少，但这是由不同的因素造成的。通过SYTO9和PI染色，共聚焦激光扫描显微镜显示，水洗是洗涤阶段细菌减少的主要原因，而菌株进入VBNC状态是喷淋解冻阶段平板计数细菌数量减少的原因。副溶血性弧菌产生的溶血毒素，在接种到虾中后毒性增强，且在整个过程中都能检测到，尤其是在速冻阶段，其含量远远高于其他阶段。tdh和trh基因表达变化也表现出与溶血毒性试验相似的趋势。其中tdh基因在冻结过程中不断增加，在渡冰衣阶段几乎达到了2倍的表达水平，而trh基因表达水平较低，不到接种前表达水平的一半。第一作者高增晖，男，西北农林科技大学健康食品制造与安全控制团队2019级硕士研究生。通信作者刘斌，男，博士，副教授，博士研究生导师。主要从事食源性致病菌在食品安全与控制方面的研究，主要研究内容包括食源性致病菌在食品中存活的机制研究和食源性致病菌在食品链中的溯源性研究。通信作者赵旭博，男，工学博士，西北农林科技大学食品科学与工程学院副教授，国家果品质量安全风险评估二级岗位科学家，国家粮油作物产品质量安全风险评估创新团队三级岗位科学家，近年来主要研究领域为：食品安全风险评估；农产品精深加工及无损检测。近几年参编普通高等教育“十一、二五”食品安全、食品生物技术及食品微生物等教材3部，以第一或通讯作者发表SCI、EI学术论文多篇，主持农业农村部农产品质量安全风险评估重大专项、“十二五”科技支撑计划子课题、国家自然科学基金面上项目、参与“十三五”国家重点研发计划子课题等纵向和横向科研项目10余项。Virulence changes in Vibrio parahaemolyticus during the freezing of Penaeus chinensisZenghui Gaoa,b,c, Heer Dinga,b,c, Ke Lid, Qiang Zhanga,b,c, Xubo Zhaoa,b,c,*, Bin Liua,b,c,*, Tianli Yuea,b,ca College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Chinab Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yangling 712100, Chinac National Engineering Research Center of Agriculture Integration Test, Yangling 712100, Chinad Zhejiang Academy of Science & Technology for Inspection & Quarantine, Hangzhou 310051, China*Corresponding author.AbstractAlthough Vibrio parahaemolyticus has become the most common pathogen in fresh and frozen seafood, its virulence changes have often been ignored during the processing of seafood. To investigate these potential risks, we used frozen Penaeus chinensis as examples, and the most virulent factors of V. parahaemolyticus, including amounts, VBNC status, toxins TDH and TRH, and virulence genes tdh and trh, were determined. Bacterial quantities were significantly reduced during drain and sprinkling phases, but caused by different factors. By SYTO9 and PI staining showed that washing was the main reason for the bacterial reduction at the drain phase, while the strain entering VBNC state was another reason at sprinkling phase. Their hemolysis toxicity, produced by TDH and TRH, became stronger after inoculation on shrimp, and could be detected throughout the process. Moreover, tdh and trh also exhibited trends similar to that of the hemolysis toxicity test. tdh was almost to a two-fold expression level during ice-glazing phase, while trh only express at a low level, less than half of the expression level before inoculation. These results demonstrated that the strains were not dead during freezing process, but became VBNC cells, which still produced and accumulated toxins, especially TDH, the most virulent factor.Reference:GAO Z H, DING H E, LI K, et al. Virulence changes in Vibrio parahaemolyticus during the freezing of Penaeus chinensis[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2362-2368. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.040.文章编译内容由作者提供编辑：梁安琪；责任编辑：张睿梅封面图片来源：图虫创意